初识微生物

优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类、产量和质量有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌种。优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类、产量和质量有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌种。

5.1 从自然界中获得新菌种
自然界中微生物资源极其丰富，土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的主要栖居和生长繁殖场所。微生物种类之多，至今仍是一个难以估测的未知数。从微生物的营养类型和代谢产物及其能在各种极端环境条件（高热、高压、低温、强碱、强酸及高渗透压等）下生存的角度分析，微生物种类应大大超过所有动植物之和。随着微生物学研究工作的不断深入，微生物菌种资源开发和利用的前景十分广阔。新的微生物菌种需要从自然生态环境中混杂的微生物群中挑选出来，因此必须要有快速而准确的新种分离和筛选方法。典型的微生物新种分离筛选过程示于图5.1.1。从以上表解可知，分离微生物新种的具体过程大体可分为采样、增殖、纯化和性能测定等步骤。

5.1.1 采样采样应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征及其生态关系等因素，确定具体的时间、环境和目标物。土壤是微生物的大本营，菜园和耕作层土壤是有机质较多的土层，常以细菌和放线菌为主；果园树根土层中，酵母菌含量较高；动植物残体及霉腐土层中，分布着较多的霉菌。此外，豆科植物根系土中，往往存在根瘤菌；河流湖泊的淤泥中能分离到产甲烷菌；油田和炼油厂周围土层中常见分解石油的微生物等。季节、表面的植被、温湿、通风情况、养分、水分、酸碱度和光照等都会影响土壤中的微生物分布，故在采土样时应予以重视。采土样地点选好后，用小铲子去除表土，取离地面5~15cm处的土样几克，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标明时间、地点和环境等情况，以备查考。各种水体也是工业微生物菌种的重要来源，许多具有光合作用能力的微生物及兼性或专性厌氧微生物都能从各种水体中筛选得到。

5.1.2 增殖在采集的样品中，一般待分离的菌种在数量上并不占优势，为提高分离的效率，常以投其所好和取其所抗的原则在培养基中投放和添加特殊的养分或抗菌物质，使所需菌种的数量相对增加，这种方法称为增殖培养或富集培养。其实质是使天然样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势菌，便于将它们从样品中分离。

5.1.3 纯化增殖培养的结果并不能获得微生物的纯种。即使在增殖培养过程中设置了许多限制因素，但其它微生物并没有死去，只是数量相对减少。一旦遇到适宜条件就会快速生长繁殖。故增殖后得到的微生物培养物仍是一个各类微生物的混合体。为了获得某一特定的微生物菌种，必须进行微生物的纯化即纯培养。常用的菌种纯化方法很多，大体可将它们分为二个层次，一个层次较粗放，一般只能达到"菌落纯"的水平，从"种"的水平来说是纯的，其方法有划线分离法，涂布分离法和稀释分离法。划线分离法简便而快速，即用接种针挑取微生物样品在固体培养基表面划线，适当条件下培养后，获得单菌落；涂布分离法与划线法类似，用涂布棒蘸取培养液，或先将少量培养液滴在固体培养基表面，再用涂布棒在固体培养基表面均匀涂布。稀释分离法所获得的单菌落更加分散均匀，获得纯种的机率较大。该法是将降至60℃左右的固体培养基与少量培养液（事先在培养液中加入无菌的玻璃珠搅拌打散细胞团，再经过滤处理，效果更佳。）混匀后，再浇注成平板以获取单菌落。另一层次是较为精细的单细胞或单孢子分离法。它可达到细胞纯即"菌株纯"的水平。这种方法的具体操作的方法很多，最简便的方法是利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离。也可以利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取。如果遇到不长孢子的丝状菌，则可用无菌小刀切取菌落边缘疏稀的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管插入菌丝尖端，以获取单细胞。在具体的工作中，究竟采取哪种方法，应视微生物的实际情况和实验条件而定。为了提高分离筛选工作的效率，除增殖培养时，应控制增殖条件外，在纯种分离时，也应控制适宜的培养条件，并选用特异的检出方法和筛选方案。

5.1.4 性能鉴定菌种性能测定包括菌株的毒性试验和生产性能测定。若毒性大而且无法排除者应予以淘汰。尽管在菌种纯化中能获得大量的目标菌株，它们都具备一些共性，但只有经过进一步的生产性能测定，才能确定哪些菌株更符合生产要求。直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。事实上，从自然界直接获得的野生型菌种往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业发酵生产。所以，我们常将这些自然界中直接获得的新菌株称为进一步育种工作的原始菌株或出发菌株。

5.2 基因突变和微生物菌种选育
5.2.1 遗传的物质基础在生物体中是否有物质专门行使遗传功能以及究竟何种物质承担此重任，是一个在历史上争论了很久的问题。十九世纪50年代孟德尔(Gregor Mendel)提出是"因子"（factor）行使着遗传功能，后来进一步确认因子就是摩尔根（Thomas Hunt Morgan）提出的"基因" （gene），并证明基因在染色体上。但染色体是由蛋白质和核酸等物质所组成的，生物体的主要物质是蛋白质，但组成蛋白质的有20种氨基酸，它的排列组合方式是个天文数字。而核酸只是由4种碱基构成的，与蛋白质相比，它的排列方式要简单得多。所以，当时人们自然推测只有蛋白质才能担负起复杂的生物遗传重任。直到本世纪40年代，由于先后有三个著名实验的论证，人们才普遍接受核酸才是真正的遗传物质。

5.2.1.1 遗传物质化学本质的确证

5.2.1.2 核酸的结构与复制

5.2.2 基因突变突变（Mutation）指生物的遗传性突然发生变异，并影响生物正常遗传的表型和性状的现象。这种突变是突然发生的，可遗传的。根据突变造成遗传物质改变的范围，可以将突变分为染色体畸变和基因突变，但它们本质上都造成了基因的突变，所以，都可以广义地理解成基因突变。

5.2.2.1 突变现象从突变的表现型可将突变分为形态突变、生化突变、致死突变和条件致死突变四类： 1）形态突变型指突变的菌体发生形态可见的变化。如细胞大小、形状、鞭毛、纤毛、孢子、芽孢、荚膜，以及群体形态结构（菌落和噬菌斑等）的改变。 2）生化突变型指突变的菌体原有特定的生化功能发生改变或丧失，但在形态上不一定有可见的变化，通过生化方法可以检测到。如菌体对底物（糖、纤维素及烃等）的利用能力、对营养物（氨基酸、维生素及碱基等）的需求、对过量代谢产物或代谢产物结构类似物的耐性以及对抗药性发生的变化。另外，它也包括细胞成分尤其是细胞表面成分（细胞壁、荚膜及鞭毛等）的细微变异而引起抗原性变化的突变。生化突变对于发酵工业生产具有重大意义。例如：很多氨基酸和核苷酸生产菌就是一些营养缺陷型的突变菌株，或是对某些代谢产物及其结构类似物的抗性菌株；对青霉素或链霉素等药物的抗性菌株，可改善发酵的管理，并可作为遗传标记以便于育种工作中的筛选和鉴别。 3）致死突变型突变造成菌体死亡或生活能力下降。致死突变若是隐性基因决定的，那么双倍体生物能够以杂合子的形式存活下来，一旦形成纯合子，则发生死亡。 4）条件致死突变型突变后的菌体在某些条件下，可以生存，但在另一些条件下则发生死亡。温度敏感突变型是最典型的条件致死突变型。有些菌体发生突变后对温度变得敏感了，在较窄的温度范围内才能存活，超出此温度范围则死亡。其原因是有些酶蛋白（DNA聚合酶，氨基酸活化酶等）肽链中的几个氨基酸被更换，从而降低了原有的抗热性。如有些大肠杆菌突变菌株能在37 ℃下生长，但不能在42 ℃下生长；噬菌体T4的几个突变株在25 ℃下有感染力，而在37 ℃下则失去感染力。以上四种突变类型的划分并不是绝对的，只是关注的角度不同，它们并不彼此排斥，往往会同时出现。营养缺陷型突变是生化突变型，但也是一种条件致死突变型。而且它常伴随着菌体形态的变化，即形态突变型。所有的突变从本质上看都可认为是生化突变型。如果从研究者能否在巨大的群体中迅速检出和分离出个别的突变体的目的来看，则只有选择性突变和非选择性突变两类。前者具选择性标记，可通过某种环境条件使它们得到生长优势，从而取代原始菌株，例如营养缺陷型和抗性突变型等。后者没有选择性标记，而只是一些数量上的差异，例如菌落大小、颜色深浅、产量高低等。

5.2.2.2 突变的诱发因素突变是怎样引起的呢？现在认为突变是可以诱发的，即在已知的物理、化学或生物因素的作用下，生物体发生突变。突变也可以是自发的，自发突变是指生物在没有人工参与的条件下所发生的突变，但这并不意味着它的发生是没有原因的，大多数自发突变本质上也是诱发的，只不过它不是人为的，而是自然环境或细胞内环境诱发的。人们将引起突变的因素称为诱发因素，诱发因素是多方面的，主要可以分为细胞外因素、细胞内因素和DNA分子内部因素三个层次

5.2.2.3 基因突变的特点

1) 基因突变的自发性及不对应性各种性状的突变都可以在没有任何人为诱变因素的作用下自发产生，这就是基因突变的自发性。基因突变的性状与引起突变的因素之间无直接的对应关系。任何诱变因素或通过自发突变过程都能获得任何性状的变异。就是说，在紫外线诱变下可以出现抗紫外线菌株，通过自发或其它诱发因素也可以获得同样的抗紫外线菌株，紫外线诱发的突变菌株也有不抗紫外线的，也可以是抗青霉素的，或是出现其它任何变异性状的突变。基因突变的自发性和不对应性已被波动测验、涂布试验和影印培养实验这三个著名的实验所证实。

2) 基因突变的稀有性虽然自发突变随时都可能发生，但自发突变发生的频率是很低的。人们把每个细胞在每一世代中发生某一性状突变的概率称为突变率(Mutation ratio)，自发突变率一般在10-6~10-9之间。突变率为108表示细胞繁殖成2×108细胞时，平均产生一个突变体。

3)基因突变的独立性突变对每个细胞是随机的，对每个基因也是随机的。每个基因的突变是独立的，既不受其它基因突变的影响，也不会影响其它基因的突变。例如巨大芽孢杆菌（Bac.megaterium）抗异烟肼的突变率是5×10-5，而抗氨基柳酸的突变率是1×10-6，对两者双重抗性突变率是8×10-10，与两者的乘积相近。

4) 基因突变的可诱变性通过人为的诱变剂作用，可以提高菌体的突变率，一般可以将突变率提高10~105倍。因为诱变剂仅仅是提高突变率，所以自发突变与诱发突变所获得的突变株并没有本质区别。

5) 基因突变的稳定性因为基因突变的原因是遗传物质的结构发生了变化，所以，突变产生新的变异性状是稳定的，也是可遗传的。

6) 基因突变的可逆性由原始的野生型基因变异成为突变型基因的过程称为正向突变(Forward mutation)，相反的过程称为回复突变(Back mutation或Reverse mutation)。实验证明，任何遗传性状都可发生正向突变，也可发生回复突变。

5.2.2.4 突变机制突变一般包括染色体数目变化、染色体结构的变化和染色体局部座位内的变化三种情况。

1) 染色体数目的变化生物细胞内染色体数目是恒定的，多一条或少一条都可能引起生物表型的变化。原核微生物只有一条DNA，若从外源获得一段DNA，且与细胞的部分DNA同源，则称为部分双倍体。与染色体结构变化同属于染色体畸变(chromosomalaberration)。

2) 染色体结构的变化这是一种大段DNA变化（损伤）现象，它包括染色体缺失(deletion)、插入（insertion）、重复 (duplication)、倒位(inversion)和易位(translocation)，大段DNA的变化会造成染色体配对时，形成特定的电子显微镜下可见的结构改变

3) 染色体局部座位内的变化即基因突变(gene mutation)，因为突变只发生在一个基因座位内，所以，又称点突变(point mutation)。基因突变可分为碱基置换（substitution）、移码突变(frame-shift mutation)、缺失(deletion)和插入(insertion)四种形式。基因突变与染色体畸变的区别在于基因突变仅仅是DNA链中一对或少数几对碱基发生了变化。

5.2.3 自发突变与定向培育

早期人们认为微生物可"驯化"或"驯养"，出现一种"定向培育"技术，即在特定环境下长期处理某一微生物培养物，同时不断地移种传代，以达到积累和选择合适的自发突变体的古老的育种方法。由于自发突变的频率较低，变异程度不大，所以，用该法培育新菌种的过程十分缓慢。与后来的诱变育种、杂交育种、尤其是基因工程等育种技术相比，定向培育是一种守株待兔式的被动育种方法，除某些抗性突变外，其它性状不是无法获得，就是需要相当长时间才能奏效。定向培育最为成功的例子是目前被广泛使用的卡介苗(BCG vaccine)。法国的卡尔密脱（Calmette）和介林（Guerin）把牛型的结核分枝杆菌接种在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上，连续传代培养230代，前后经历13年时间，终于在1923年获得显著减毒的结核杆菌--卡介苗。早年，巴斯德曾用42℃去培养炭疽杆菌，经过20天后，该菌丧失产芽孢能力。经2-3月后，菌体进一步失去致病能力，因而可用作活菌苗使用。利用它来接种，在预防牛、羊的炭疽病方面，曾获得良好的成效。巴斯德也曾将疯狗的唾液注入健康兔子脑中长期传代"驯化"，制成疫苗，救治狂犬病患者，开创了人类免疫学。当时，人们只是认为微生物与禽畜一样，长期处在特定环境中是可以被"驯服"的，并没有认识到实际上利用了自发突变。虽然定向培育作为一种古老而低效的育种方法现已被淘汰，但是人们仍然继续在利用菌体的自发突变现象。例如从污染噬菌体的发酵液中分离得到抗噬菌体的菌株；又如在酒精发酵工业中，曾有过一株分生孢子为白色的糖化菌"上酒白种"，就是在原来孢子为黑色的宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）3758发生自发突变后，及时从生产过程中挑选出来的。这一菌株不仅产生丰富的白色分生孢子，而且糖化率比原来菌株强，培养条件也比原菌株粗放。这也就是积极的菌种复壮工作。

5.2.4 诱变育种诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究用。当前发酵工业和其他生产单位所使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的菌株。诱变育种除能提高产量外，还可达到改善产品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的。诱变育种具有方法简单、快速和收效显著等特点，故仍是目前被广泛使用的主要育种方法之一。

5.2.4.1 诱变剂及其诱发机理各种性状的突变都可以在没有人为因素的条件下自发地进行，但自发突变的突变率很低，获得符合要求的突变株的可能性很小。在人工的物理化学诱变因素作用下，菌株的突变率得以大大提高，具有利性状的突变株被筛选到的可能性大大增强。这些物化诱变因素又称为诱变剂。

5.2.4.2 诱变育种方法从自然界直接分离到的野生型菌株积累产物的能力往往很低，无法满足工业生产的需要，这就要求我们对它们进行菌种改造，即育种。育种的手段很多，从微生物育种发展的历史看，有定向培育、诱变育种、杂交育种、细胞融合和基因工程等育种技术。目前，诱变育种对于微生物工作者来讲仍是一个最有效而实用的方法

5.3 杂交育种
将二个不同性状个体内的基因转移到一起，经过重新组合后，形成新的遗传型个体的过程称为基因重组(gene recombination)。基因重组是生物体在未发生突变的情况下，产生新的遗传型个体的现象。杂交育种（Hybridization）一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核微生物的接合、F因子转导、转导和转化等过程，促使两个具不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。这也是一类重要的微生物育种手段。比起诱变育种，它具有更强的方向性和目的性。杂交是细胞水平的概念，而基因重组是分子水平的概念。杂交育种必然包含着基因重组过程，而基因重组并不仅限于杂交的形式。

5.3.1真核微生物的基因重组在自然环境中，真核微生物就存在有性生殖和准性生殖等基因重组的形式。利用这些基因重组形式所进行的有性杂交和准性杂交，可以培育出优良的生产菌株。本节主要讨论酵母菌有性杂交和霉菌的准性杂交。

5.3.1.1酵母菌的有性杂交酵母菌的生活史既包括二倍体、单倍体世代，又包括有性和无性世代。工业上应用甚广的酿酒酵母通常是双倍体酵母菌，并且只进入无性世代。酿酒酵母产子囊孢子的能力已退化，所以，要使这些酵母菌发生基因重组，应先诱使其产生子囊孢子，再使两个不同性状的亲本发生接合，形成二倍体的杂交后代。

5.3.1.2霉菌的准性生殖（parasexual hybridization）霉菌的基因重组一般也可以通过有性生殖过程完成，即二个来源不同的孢子发生质配、核配，形成重组体细胞。这是霉菌基因重组的主要方式。而有些霉菌的基因重组则可以采取另一形式--准性生殖。顾名思义，准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更原始的生殖方式，见表5.3.1。准性生殖可发生在同一生物的二个不同来源的体细胞之间，经细胞融合但不发生减数分裂，导致低频率的基因重组。准性生殖常见于某些真菌，尤其是半知菌类。

5.3.2 原核微生物的基因重组自然状态下，原核微生物也会发生基因重组。原核微生物基因重组包括接合、F因子转导、转导和转化四种形式。但是，自然条件下，原核微生物基因重组的频率和参与重组的基因是有限的，虽然可以通过人为施加理化影响，以提高基因重组发生的频率，但是，应用这些基因重组形式进行杂交育种来培育高产菌株的成功实例还不多见。

5.3.2.1细菌的接合（Conjugation）所谓接合，就是指通过供体菌和受体菌的完整细胞经直接接触、传递大段DNA（包括质粒）遗传信息的现象。接合现象存在于细菌和放线菌中，其中，对大肠杆菌的接合现象已研究得较为清楚，见图5.3.3。根据对接合现象的研究发现大肠杆菌存在性别分化，决定它们性别的是F因子（即致育因子）。F因子是一种染色体外的环状DNA小分子，属细菌质粒。它可自身复制，并可转移至别的细胞。一般每个细胞可有1-4个。它既可脱离染色体在细胞中独立存在，也可插入到细菌染色体上，我们将这种外来DNA片段插入染色体中的过程称为整合。整合态的外来DNA将与染色体同步复制。凡有F因子的菌株，细胞表面会产生1-4个中空、细长的性线毛，性线毛的功能是在细菌接合时帮助转移DNA。有人认为DNA是从性线毛的中间（f2.5nm）穿过，也有人认为性线毛只是连接并收缩使受体细胞和供体细胞相接触，再形成特殊的通道，至于DNA传递过程的细节还不清楚。

5.3.2.2 F因子转导(F-mediated transduction) F因子转导又称性导(sexduction)。如前所述，F因子能够以整合态或游离态存在于细胞内，整合态的F因子，可重新成为游离态的F因子，此过程称反整合，见图5.3.7。但在反整合过程中，若发生在非正常配对区域，那么游离出来的F因子将携带部分染色体片段，造成细胞的染色体发生缺失，而F因子也缺失一段DNA，此时的F因子称Fˊ因子。此时的细胞称为初生Fˊ细胞，因为Fˊ因子携带一段染色体DNA，所以，Fˊ因子对初生Fˊ细胞是必需的。当初生Fˊ细胞与F-细胞发生接合，则使F-细胞成为次生Fˊ细胞。次生Fˊ细胞中的F因子可能不完整，因为在反整合时失去了一段DNA，但少数染色体基因有两套，成为部分双倍体，此时的Fˊ因子对次生Fˊ细胞不是必需的。如果次生Fˊ细胞中Fˊ因子发生整合和错误的反整合，就有可能使供体菌的某些基因，重组进入受体菌的染色体中。这个过程类似于细菌转导，但它是以F因子为供体基因携带者，且受体细胞与供体细胞需直接接触，所以，人们将这种基因重组的方式称为F因子转导。因为F因子可在细菌的染色体多位点整合，所以F因子转导可实现不同基因的转移和重组。

5.3.2.3 转导（Transduction）借助温和型噬菌体为媒介，把供体细胞中DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称转导。获得新遗传性状的受体细胞称为转导子（transductant）。转导过程不需要细胞接触，而是以噬菌体为载体。转导主要分为普遍性转导和局限性转导两种类型

5.3.2.4转化（transformation）某一基因型的细胞直接从周围介质中吸收另一基因型细胞的DNA，并将它整合到自己的基因组中，造成基因型和表型发生相应变化的现象称为转化。转化现象在原核生物中普遍存在，如在前述的Griffith的转化实验中，S-II型肺炎链球菌的DNA转化了R-II型的肺炎链球菌，使后者成为S-II型的肺炎链球菌。在少数真核微生物如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粗糙脉孢霉(Neuraspora crassa)和黑曲霉(Aspergillus niger)中也有转化的报道。两个菌种的菌株间能否在菌体间发生转化与它们在进化中亲缘关系有关。但即使在转化率极高的那些种中，不同的菌株间也不一定都能发生转化。研究表明能被转化的细胞还必须是感受态（competence）细胞。所谓感受态就是指细胞能从周围环境吸收DNA分子，将其整合入自己的基因组，并保证不被体内DNA酶破坏的生理状态。它与受体细胞的遗传性、生理状态、菌龄和培养条件等因素有关。肺炎链球菌的感受态出现在生长曲线中的对数生长期的后期，而芽孢杆菌的一些菌种大多出现在对数生长期末及稳定期。加入环腺苷酸（cAMP）或Ca++可提高感受态水平。如cAMP可使嗜血杆菌细胞群体的感受态水平提高一万倍。实现转化所需的DNA浓度是极低的，例如在群体中含有15%感受态细胞的情况下，每毫升细胞悬液只要有0.1微克DNA就能有效地发生转化。

5.4 原生质体融合（Protoplast Fusion）
原生质体融合是通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，亦可称为"细胞融合"（cell fusion）。原生质体融合技术始于1976年,最早是在动物细胞实验中发展起来的，后来，在酵母菌、霉菌、高等植物、以及细菌和放线菌中也得到了应用。原生质体融合技术是继转化、转导和接合等微生物基因重组方式之后，又一个极其重要的基因重组技术。应用原生质体融合技术后，细胞间基因重组的频率大大提高了，在某些例子中，原生质体的重组频率已大于10-1(而诱变育种一般仅为10-8)。如今，能借助原生质体融合技术进行基因重组的细胞极其广泛，包括原核微生物、真核微生物以及动植物和人体的细胞。发生基因重组亲本的选择范围也更大了，原来的杂交技术一般只能在同种微生物之间进行，而原生质体融合可以在不同种、属、科，甚至更远缘的微生物之间进行。这为利用基因重组技术培育更多、更优良的生产菌种提供了可能。微生物原生质体融合的一般原理和过程见图5.4.1。主要步骤为：选择亲株、制备原生质体、原生质体融合、原生质体再生及筛选优良性状的融合子。

5.4.1选择亲株为了获得高产优质的融合子，首先应该选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株。同时，为了能明确检测到融合后产生的重组子并计算重组频率，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等。可以通过诱变剂对原种进行处理来获得这些遗传标记。在进行原生质体融合前，应先测定菌株各遗传标记的稳定性，如果自发回复突变的频率过高，应考虑该菌株是否适用。

5.4.2原生质体制备去除细胞壁是制备原生质体的关键。一般都采用酶解法去壁。根据微生物细胞壁组成和结构的不同，需分别采用不同的酶，如溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶等。有时需结合其它一些措施，如在生长培养基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高细胞壁对酶解的敏感性。一些微生物的去壁方法见表5.4.1。革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖组成。溶菌酶是一种内-N-乙酰胞壁酰胺酶，能切开肽聚糖中N-乙酰氨基葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的b-1,4-糖苷键。溶菌酶能溶解微球菌、枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰氏阳性菌的细胞壁。而溶菌酶对革兰氏阴性菌不能直接溶壁，只有当乙二胺四乙酸（EDTA）存在时，某些革兰氏阴性菌的细胞壁才能够被溶菌酶溶解。溶菌酶不能溶解金黄色葡萄球菌的细胞壁，而表皮葡萄球菌能产生一种内肽酶--葡萄球菌素（Lysostaphin）可以切开肽聚糖中肽的连键，可以用于溶解葡萄球菌的细胞壁。放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌也可采用溶菌酶。真菌细胞壁主要由纤维素、几丁质和葡聚糖等组成。青霉菌多用纤维素酶和a-1,3-糖苷酶等溶壁；曲霉用b-1,3-糖苷酶和b-1,4-糖苷酶等。不同菌种往往需要不同的酶或多种酶混合使用才能达到较好的溶壁效果；蜗牛酶能较好地溶解酵母菌细胞壁中的葡聚糖和几丁质等成分

5.4.3原生质体融合早期的原生质体融合实验中，曾采用离心力作用使两种细胞的原生质体紧紧挤在一起以帮助融合，或者在冷的渗透稳定剂中使原生质体密集凝聚，但这些方法的效果不佳。后来有人发现聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合。PEG促进原生质体融合的机理并不清楚，有人推测助融作用可能与下列过程有关：开始由于强烈的脱水而使原生质体粘在一起，并形成聚合体。原生质体收缩并高度变形，使原生质体之间的接触面增大，细胞膜结构发生紊乱，从而加大了细胞膜的流动性，膜内的蛋白质和糖蛋白相互作用和混合，使紧密接触的原生质体相互融合。但是，PEG对细胞尤其是原生质体有一定的毒害作用，因此作用的时间一般不宜过长。微生物的原生质体只需要与PEG接触一分钟，就应尽快加入缓冲液进行稀释。PEG有不同的聚合度，在细菌原生质体融合中，多采用高分子量的PEG（如PEG6000）, 对放线菌则可采用各种分子量的PEG。一般PEG的使用浓度范围在25-40%。另外，紫外线照射或脉冲电场等物理因素处理也能促进原生质体融合。

5.4.4原生质体再生原生质体再生就是使原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构。不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，甚至一些非常接近的种，最适再生条件也往往有所差别，如再生培养基成分及培养温度等。但最重要的一个共同点是都需要高渗透压。能再生细胞壁的原生质体只占总量的一部分。细菌一般再生率为3-10%。但有资料报道，在再生培养基中添加牛血清白蛋白，可使枯草杆菌原生质体的再生率达100%。真菌再生率一般在20-80%。链霉菌再生率最高可达50%。为获得较高的再生率，在实验过程中应避免因强力使原生质体破裂。再生平板培养基在涂布原生质体悬液前，宜预先去除培养基表面的冷凝水。涂布时，原生质体悬液的浓度不宜过高。因为若有残存的菌体存在，它们将会率先在再生培养基中长成菌落，并抑制周围原生质体的再生。另外，菌龄、再生时的温度、溶菌酶用量和溶壁时间等因素都会影响原生质体的再生。

5.4.5 筛选优良性状融合重组子原生质体融合后，来自两亲代的遗传物质经过交换并发生重组而形成的子代称为融合重组子。这种重组子通过两亲株遗传标记的互补而得以识别。如两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B和A-B+，融合重组子应是A+B+或A-B-。重组子的检出方法有两种：直接法和间接法。直接法将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子；间接法把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。从实际效果来看，直接法虽然方便，但由于选择条件的限制，对某些重组子的生长有影响。虽然间接法操作上要多一步，但不会因营养关系限制某些重组子的再生。特别是对一些有表型延迟现象的遗传标记，宜用间接法。若原生质体融合的两亲株带有抗药性遗传标记，可以用类似的方法筛选重组子

5.5 基因工程（gene engineering）
基因工程是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来，在离体条件下切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。

目标基因可以从酶切的供体细胞染色体碎片中获得，或首先提取目标产物的mRNA，然后将其反转录合成cDNA而获得，或从目标蛋白的氨基酸顺序推测出基因的碱基顺序，人工合成DNA片段。将目标基因的两端和载体DNA的两端用特定的核酸内切酶酶切后，让它们连接成环状的重组DNA。因为这是在细胞外进行的基因重组过程，所以，有人将基因工程又称为体外重组DNA技术。以质粒为载体的重组体DNA可以通过转化进入受体细胞，而用噬菌体为载体的重组DNA可以通过转导或转染进入受体细胞。

重组DNA在受体细胞中将自主复制扩增。多拷贝的重组DNA将有利于积累更多的目标产物。虽然基因工程的操作有着非常强的方向性，但是，最终获得的并非是目标重组体的纯培养物，因为还有许多其它的细胞存在，如：目标基因可能没有被重组、重组的目标基因可能是反向的、重组DNA无法稳定存在于受体细胞中等。所以，筛选仍然是基因工程育种工作中的重要内容。因为在载体DNA中可以较容易地设置多种特定遗传标记（如药物抗性标记），因此筛选工作的目标性和有效性很高，是其它育种工作所无法比拟的。目前，基因工程的应用已不是理想，而是现实。已不只是实验室中的研究，而是有大量基因工程产品已经商品化生产。微生物的育种已进入了崭新的革命时代。回顾微生物育种方式的历史，可发现育种的手段和技术不断发展。最早人们认为微生物可"驯化"，出现一种"定向培育"技术。后来随着对遗传变异现象认识的深入出现了诱变育种，通过诱变剂促进突变频率的提高，但这种方法有很大的盲目性，基因变异的程度也有限，特别是经过长期诱变处理，产量上升变得越来越缓慢，甚至无法继续提高。几乎与诱变育种在同一时期，由于对微生物有性生殖、准性生殖、转化及转导接合等现象的研究，出现了杂交育种即基因重组技术。因为是在已知不同性状的亲本间杂交，所以方向性和自觉性比诱变育种更进了一步。但杂交育种方法较复杂，而且需要有合适的亲本（亲本间应具有能互补的优良遗传性状及亲本间有性的亲和性）。 1976年开始，原生质体融合进一步发展了杂交育种技术，它可使一些未发现有转化、转导和接合等现象的原核生物之间，及微生物不同种、属、科间甚至更远缘的微生物的细胞间进行融合，获得新物种。但原生质体融合的难度也很大，并非每次都能成功。 70年代出现的基因工程给微生物育种带来了革命。它不同于传统的育种方法，所创造的新物种是自然演化中不可能发生的组合。这是一种自觉的、能象工程一样事先设计和控制的育种技术，可以完成超远缘杂交，是最新最有前途的育种方法。但是，基因工程的应用仍有很大的局限性。基因工程产品主要还是一些较短的多肽和小分子蛋白质（见第十一章）。因为基因工程的实施首先需要对生物的基因结构和顺序有充足的认识，而我们对基因的了解还十分有限，蛋白质类以外的发酵产物（如糖类、有机酸、核苷酸及次级代谢产物）产生往往受到多个基因的控制，尤其是还有许多发酵产物的代谢途径还没有被确证，所以，对于这些产物，基因工程（包括代谢工程）还难以完全取代传统的菌种选育方法。目前，我们已可以通过基因工程手段，将已知的控制产物的调控基因进行改造，或将有关的调控基因或有关代谢途径中的酶的基因导入菌体，也可以加强代谢途径中有关酶的表达，以提高发酵产量或生产新产品，这就是所谓的代谢工程，见第十一章。

5.6 菌种筛选方法
所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的少数。要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，就象是大海捞针，工作量很大。简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的关键。为了花费最少的工作量，在最短的时间内取得最大的筛选成效，就要求采用效率较高的科学筛选方案和手段。因为诱变育种中的筛选工作最复杂，所以，本节主要讨论诱变育种的筛选方法，这些方法也为其它育种方法的筛选提供了借鉴。

5.6.1菌种筛选方案在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。

5.6.2 菌种筛选的手段筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求，对于初筛，要力求快速、简便，对于复筛，应该做到精确，测得的数据要能够反映将来的生产水平。

5.6.2.1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。

5.6.2.2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图5.6.1。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图 5.6.1 平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。

1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。

2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。

3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就会形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力。在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或产酸能力的大小。

4) 生长圈法利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下，能合成该营养物，或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物，那么，在这些菌的周围就会有工具菌生长，形成环绕菌落生长的生长圈。该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌。工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。

5) 抑制圈法待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质，或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对工具菌有毒的物质，从而在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。例如：将培养后的单菌落连同周围的小块琼脂用穿孔器取出，以避免其它因素干扰，移入无培养基平皿，继续培养4-5天，使抑制物积累，此时的抑制物难以渗透到其它地方，再将其移入涂布有工具菌的平板，每个琼脂块中心间隔距离为2厘米，培养过夜后，即会出现抑菌圈。抑菌圈的大小反映了琼脂块中积累的抑制物的浓度高低。该法常用于抗生素产生菌的筛选，工具菌常是抗生素敏感菌。由于抗生素分泌处于微生物生长后期，取出琼脂块可以避免各菌落所产生抗生素的相互干扰。典型的例子是春雷霉素生产菌的筛选，见图5.6.2。

5.6.2.3 摇瓶培养法摇瓶培养法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中，振荡培养，然后，再对培养液进行分析测定。摇瓶与发酵罐的条件较为接近，所测得的数据就更有实际意义。但是摇瓶培养法需要较多的劳力、设备和时间，所以，摇瓶培养法常用于复筛。但若某些突变性状无法用简便的形态观察或平皿快速检测法等方法检测时，摇瓶培养法也可用于初筛。初筛的摇瓶培养一般是一个菌株只做一次发酵测定，从大量菌株中选出10-20%较好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株培养3瓶，选出3-5个较好的菌株，再做进一步比较，选出最佳的菌株。

5.6.3 特殊变异菌的筛选方法上述一般的筛选菌株方法的处理量仍是很大的，为了从存活的每毫升106左右细胞的菌悬液中筛选出几株高产菌株，要进行大量的稀释分离、摇瓶和测定工作。虽然平皿快速检测法作为初筛手段可减少摇瓶和测定的工作量，但稀释分离的工作仍然非常繁重。而且有些高产变异的频率很低，在几百个单细胞中并不一定能筛选到，所以，建立特殊的筛选方法是极其重要的。例如营养缺陷型和抗性突变菌株的筛选有它们的特殊性，营养缺陷型或抗性突变的性状就象一个高效分离的"筛子"，以它为筛选的条件，可以大大加快筛选的进程并有效地防止漏筛。在现代的育种中，常有意以它们作为遗传标记选择亲本或在DNA中设置含这些遗传标记的片段，使菌种筛选工作更具方向性和预见性。本节还将简单介绍其它一些特殊变异株的筛选方法。

5.6.3.1营养缺陷型突变株的筛选经诱变处理后的菌悬液在筛选前一般应先进行诱变后培养，以促使变异细胞发生分离，防止出现表型延迟现象，筛选出不纯的菌株。营养缺陷型的筛选一般包括浓缩、进一步检出和鉴别营养缺陷型等步骤。

1) 浓缩营养缺陷型菌株诱变后的细胞群体中大部分存活菌是野生型，而营养缺陷型占的比例相当小，这对分离是很不利的，所以，应该淘汰大量的野生型，以达到浓缩营养缺陷型的目的。常用的浓缩方法有抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。

2)进一步检出所需缺陷型浓缩后的菌液中营养缺陷型的比例较大，但并非全部都是。并且营养缺陷型中也有不同的类型，还需要进一步检出所需要的营养缺陷型。这样就需要采用逐个检出法、夹层培养法和限量补给法等方法进一步检出所需要的营养缺陷型。

3)营养缺陷型的鉴定获得的营养缺陷型菌株还应进一步确认其生长的所需物。菌株较少时，可用生长谱法，若菌株较多时，常采用组合补充培养基法

5.6.3.2 抗性突变菌株的筛选抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有10-6频率的突变体存在，就容易筛选出来。抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性筛选法两种手段。

1) 一次性筛选法一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。噬菌体抗性菌株常用此方法筛选。将对噬菌体敏感的出发菌株经变异处理后的菌悬液大量接入含有噬菌体的培养液中，为了保证敏感菌不能存活，可使噬菌体数大于菌体细胞数。此时出发菌株全部死亡，只有变异产生的抗噬菌体突变株能在这样的环境中不被裂解而继续生长繁殖。通过平板分离即可得到纯的抗性变异株。耐高温菌株在工业发酵中的应用意义在于它可以节约冷却水的用量，尤其是在夏季，并能减少染菌的机会。耐高温菌株所产生酶的热稳定性较高，适用于一些特殊的工艺过程。耐高温菌株也常采用此法筛选。将处理过的菌悬液在一定高温下处理一段时间后再分离。对此温度敏感的细胞被大量杀死，残存的细胞则对高温有较好的耐受性。耐高浓度酒精的酵母菌的酒精发酵能力较高，也适宜提高发酵醪浓度，提高醪液酒精浓度。而耐高渗透压的酵母菌株具有积累甘油的性能，可用于甘油发酵。耐高酒精度、高渗透压的菌株也可分别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高渗环境下一次性筛选获得。

2)阶梯性筛选法药物抗性即抗药性突变株可在培养基中加入一定量的药物或对菌体生长有抑制作用的代谢物结构类似物来一次性筛选，大量细胞中少数抗性菌在这种培养基平板上能长出菌落。但是在相当多的情况下，无法知道微生物究竟能耐受多少高浓度的药物，这时，药物抗性突变株的筛选需要应用阶梯性筛选法。因为药物抗性常受多位点基因的控制，所以药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的，先是可以抗较低浓度的药物，而对高浓度药物敏感，经"驯化"或诱变处理后，可能成为抗较高浓度药物的突变株。阶梯筛选法由梯度平板或纸片扩散在培养皿的空间中造成药物的浓度梯度，可以筛选到耐药浓度不等的抗性变异菌株，使暂时耐药性不高，但有发展前途的菌株不致于被遗漏，所以说，阶梯性筛选法较适合于药物抗性菌株的筛选，特别是在暂时无法确定微生物可以接受的药物浓度情况下

5.6.3.3 组成酶变异株的筛选

许多水解酶是诱导酶，只有在含有底物或底物类似物的培养环境中，微生物才会合成这些酶类，所以，诱导酶的生产不仅需要诱导物，而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）往往会引起酶合成的减少，诱导物有时又比较昂贵。这些都可能造成这些水解酶工业生产的波动以及生产成本提高。如果控制这些酶合成的调节基因发生了变异，诱导酶就可能转变成组成酶，它的合成与细胞的其它组织蛋白一样，不再需要诱导物的存在。由诱导型的出发菌株诱变筛选出组成型变异株对于水解酶的工业生产具有重要的现实意义。具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和诱导抑制物法。

1) 恒化器法恒化器常被用于微生物的"驯化"。在培养基中添加不能起诱导作用的低浓度底物，接入处理后的菌悬液进行培养，此时出发菌株由于不能被诱导，无法合成有关的诱导酶而不能分解该底物，从而生长速率极慢，而群体中少数组成型变异株则可合成有关的酶，分解利用该底物，生长速率较快。为了提高组成酶变异株的优势，即它在群体中的比例，可以应用恒化器培养技术。随着恒化器培养中不断加入新鲜基质而逐渐增大组成酶变异株的优势，这样就能够比较容易地做进一步的纯化分离。

2) 循环培养法利用不含诱导物的培养环境和含有诱导物的培养环境进行交替循环培养待分离的菌悬液，从而使组成酶变异株得到富集。当接种到不含诱导物而含有其它可利用碳源的培养基中时，两种类型菌株同样能较好地生长，但在此环境中组成型突变株已能合成有关的水解酶，而诱导型菌株就不能合成。进而将它们转接入含诱导物的培养基中时，变异株能迅速利用诱导底物进行生长繁殖，而诱导型出发菌株需经历一个诱导合成酶的阶段，两类菌株的生长就不同步了，随着循环交替培养的继续，组成酶变异株所占的比例将逐渐增大。

3) 诱导抑制剂法有些化合物能阻止某些诱导酶的合成，如α-硝基苯基-β-岩藻糖苷对大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的诱导合成有抑制作用，称为诱导抑制剂。当在诱导物和诱导抑制剂同时存在的培养环境中培养待分离菌群时，诱导型菌株不能产生诱导酶，无法正常生长，只有组成型变异株能够利用底物进行生长繁殖。

5.6.3.4高分子废弃物分解菌的筛选随着石油化工和塑料工业的发展，各种高分子包装废弃物日益增多，这些"白色污染"在自然界很难被消化而进入物质循环。设法选育能分解利用这些高分子材料的微生物对于环境保护至关重要。这些高分子材料大多是不溶于水的，直接分离具有分解功能的微生物很困难。为此，有人设计了阶段式筛选法，首先寻找能在与聚乙二醇结构相似的含两个醚键的三甘醇上生长的微生物，接着，诱变筛选能分解聚乙二醇的变异株；或者筛选能以乙二醇、丙二醇为碳源的菌株，继而诱变筛选出能利用聚乙二醇等物质的变异株。这种由简单的聚合物单体入手逐级筛选高分子废弃物分解菌也许是一条有效的筛选思路。

5.6.3.5无泡沫菌株及高凝聚性菌株的筛选有些菌在发酵过程中会产生大量的泡沫，从而造成发酵液满溢，增大了染菌的机会，使发酵体系反应不均匀，也有可能引起某些发酵产物的生物活性丧失，如蛋白酶变性失活。为了避免泡沫的产生，常常需通过牺牲发酵液的装量或加入大量的消泡剂来消除泡沫的不利影响。发酵过程产生泡沫是菌体代谢、培养基和发酵工艺等方面的原因造成的，而菌种是产生泡沫的关键，选育无泡沫或少泡沫菌株可以从根本上解决泡沫问题。有人用气泡上浮法筛选出了无泡沫的酒精酵母。将变异处理后的菌悬液接种入生长培养基中，培养器皿的底部放置无菌压缩空气喷口，培养过程中不断通入无菌空气，形成鼓泡，易产生泡沫的酵母菌会随泡沫而除去，留下的是不易产生泡沫的变异菌株；也有人用苯胺蓝染色法进行筛选，将经过变异处理的菌悬液经培养后涂布在含葡萄糖3%、酵母膏0.5%、苯胺蓝0.005%的平板上培养4天，出发菌株呈浅蓝色，变异菌株因细胞壁成分和结构改变造成与染料结合力改变，少泡沫的变异菌株呈深蓝色。啤酒发酵和单细胞蛋白培养都希望由凝聚性较好的酵母菌株担任发酵菌种，以便于啤酒的澄清和保持良好的风味，以及单细胞蛋白的收集。采用上述的泡沫上浮法也可以除去不易凝聚的细胞，通过改变鼓泡速度的调节，可以获得具不同凝聚性的菌株。

转自中国生命科学论坛微生物版ocean贴